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                GSH對低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體 AsA-GSH循環代謝的影響

                  引言  枇杷(Eriobotrya Japonica Lindl)是福建省的地方名特優果品。[1]枇杷品種為耐寒性較差的熱帶型品種,低溫脅迫是熱帶型枇杷品種生長的關鍵限制性因子。近年我國南方山地枇杷產區都有不同程度的凍害發生。熱帶型枇杷在我國現有枇杷栽培面積和產量中占有較大的比重,研究當前枇杷生產上存在枇杷幼果受凍的突出問題以減少因凍害造成的損失具有一定的實際意義和理論價值。谷胱甘肽(GSH)是植物體內普遍存在的還原性物質,在防禦自由基對膜脂的過氧化中起到重要作用。相關研究表明,生物膜是低▓溫脅迫對植物造成傷害的原初作用部位和反應部位,臨界低溫下膜上類脂發生由液晶相向凝膠相的轉變,並引發如膜透性增大和膜結合酶活化能增高等繼發反應,導致組織不可逆傷害的發生。[2, 3]關於GSH對低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體AsA-GSH循環代謝影響的研究未見相關報道。本試驗擬采用不同質量濃度的外源GSH處理低溫脅迫下枇杷幼果,探討外源GSH處理對葉綠體AsA-GSH循環代謝的影響,以期為GSH在提高枇杷幼果抗寒性方面的應用提供理論依據。 
                1 材料與方法 
                1.1 供試材料   以“早鐘6號”三年生枇杷容器苗為試材,選取長勢一致、無病蟲害與損傷、生長正常、花後60 d的枇杷容器苗(已疏果),以100、300、400和500 mg·L-1等不同質量濃度的GSH (分別在表中標記為T1、T2、T3與T4) 溶液100 mL均勻噴施於葉面和幼果,以無低溫脅迫噴清水處理為對照1 (CK1),以低溫脅迫加噴清水處理為對照2 (CK2)。每個處理5株。將經GSH處理和CK2容器苗置於人工氣候室-3℃低溫下處理6 h,後於室溫下平衡10 h,迅速取下幼果經液氮速凍後保存於-40℃低溫冰箱,待測相關指標,見表1。  表1 試驗條件  GSH質量濃度  (mg·L-1)  溶液標記 對照1 對照2 備註 100  T1 „ „ „ 300 T2 „ „ „ 400 T3 „ „ „ 500  T4  „  „  „         註:以無低溫脅迫噴清水處理為對照1 (CK1),以低溫脅迫加噴清水處理為對照2 (CK2)
                1.2 主要試劑與儀器  本試驗使用的牛血清白蛋白(Albumin,Fraction V)、磷酸緩沖液、三氯乙酸(TCA)、考馬斯亮藍G-250、30%過氧化氫、L-半胱氨酸、β-巰基乙醇、乙二胺█四乙酸(EDTA)、Tris-HCl緩沖液、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)和NaCl等試劑為國產分析純或生物級試劑。主要儀器有:MDF-U4086S型超低溫冰箱(日本三洋)、5415R型Eppendorf冷凍離心機(德國產)和Eppendorf移液槍(德國產)等。 
                1.3 測定項目與方法 
                1.3.1 葉綠體的制備  參考崔彬彬等(2006)的方法提取█完整葉綠體[10]。以緩沖液(含0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液PBS,5.0 mmol·L-1的EDTA,pH 7.8)懸浮葉綠體,用於測定APX、GR、MDHAR和DHAR活性以及GSH和AsA 3含量。 
                1.3.2 GSH和AsA含量測定  取葉綠體懸浮液1.0 mL,加1.5 mL蒸餾水和5%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻,於6600 rpm離心10 min,上清液定容至5.0 mL,用於測定GSH含量,GSH含量測定參照Ellman(1959)的方法。取葉綠體懸浮液1.0 mL於2600 rpm離心10 min,沈澱用於制備10%葉綠體勻漿液(葉綠體重量/生理鹽水體積為1: 9),用於測定AsA含量,AsA的測定參照陳建勛等(2002)的方法。[4] 1.4 數據分析  上述測定均設3次獨立試驗,每次3個重復。測定所得數據經Duncan’s新復極差法進行方差分析, 檢驗差異顯著性。 

                2 結果與分析 
                2.1 GSH對低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體GSH含量的影響  谷胱甘肽是植物體內重要的抗氧化劑與氧化還原勢的調節劑。由圖1可知,經GSH處理的枇杷幼果葉綠體中GSH含量均高於CK2,差異達顯著水平(P<0.05)。說明GSH處理可提高低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體中GSH的含量,其中以100 mg·L-1的GSH處理的枇杷幼果葉綠體GSH含量極顯著高於CK1和CK2以及300 mg·L-1和500 mg·L-1的GSH處理(P<0.01)。CK1枇杷幼果葉綠體的GSH含量高於CK2,差異達顯著水平(P<0.05=,表明低溫脅迫降低了枇杷幼果葉綠體GSH含量。 
                2.2 GSH對低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體AsA含量的影響  AsA在APX的參與下清除細胞內的H2O2,減輕低溫脅迫等逆境條件下引發的膜脂的過氧化傷害。經GSH處理的幼果葉綠體AsA含量均高於CK2,差異達顯著水平(P<0.05)。其中以100 mg·L-1的GSH所處理的幼果葉綠體中AsA含量最高,但300 mg·L-1和500 mg·L-1的GSH所處理的枇杷幼果葉綠體中AsA含量低於CK1 (圖2)。                      CK1: 無低溫脅迫的0 mg.L-1  GSH處理;CK2: 經低溫脅迫和0 mg.L-1  GSH處理;T1: 經低溫脅迫和100 mg.L-1  GSH處理; T2: 經低溫脅迫和300 mg.L-1 GSH處理; T3: 經低溫脅迫和500 mg.L-1 GSH處理;下同。 
                2.3 GSH對低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體中MDHAR活性的影響  細胞內MDHA在MDHAR的作用下被還原成AsA,使AsA得以再生,推動AsA-GSH的循環代謝。 „„ 

                3 討論  細▓胞內活性氧自由基的積累使膜脂質過氧化作用加強, 是低溫脅迫導致細胞傷害與死亡的重要機 制之一,胞內H2O2在正常情況下可通過Halliwell-Asada途徑清除[5]。此反應所產生的氧化型谷胱甘肽(GSSG)又可在谷胱甘肽還原酶(GR)的█催化下被還原成GSH;另一部分MDHA則被單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR,EC 1.6.5.4)還原為AsA。[18]  GSH作為AsA-GSH循環代謝的重要組成部分參與或直接清除胞內活性氧自由基, 谷胱甘肽還原酶(GR,EC 1.6.4.2)的活性影響到胞內GSH庫的水平,植物對環境脅迫的抵抗能力與該酶活性的變化密切 相關。[2,7, 8, 9] 本試驗研究發現,100 mg·L-1的外源GSH處理可顯著提高低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體GSH含量和GR活力(P<0.05);較高濃度(300和500 mg·L-1)的外源GSH處理對GR活力表現出強烈的抑制作用(即低於CK2),但它們的GSH含量卻高於CK2,這可能與葉綠體吸收外源GSH導致其含量上升繼而對GR起抑制作用有關。[18]  4 結論  葉綠體中高含量的GSH能促進葉綠體AsA-GSH循環,使葉綠體內AsA含量增加以及APX、MDHAR和GR活性相應█提高[19]。本研究結果表明,采用100 mg·L-1的外源GSH處理可提高低溫脅迫下枇杷幼果葉綠體中抗氧化劑GSH和AsA含量以及APX、GR和MDHAR的活性,這些非酶抗氧化物質與酶之間的協調作用,促進AsA-GSH循環,葉綠體清除自由基的能力增強,維持葉綠體內較低的膜脂過氧化水平,可能與提高枇杷幼果的抗寒性有關。  致謝:  我的畢業論文試驗讓吳老師花費大量的心血,在此感謝吳敏生教授在試驗方面的耐心指導與幫助;同時我還要感謝李露露老師還有其他老師和同學的熱心幫助與支持。 
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